Синтез пептидов.
Модификация и конъюгация пептидов

Количество
от 1 мг до 10гр
Чистота
от 95% до 98%
Длина
от 2 до 50ак
Подлинность МС
с электроспрей ионизацией
  • Синтезируем пептиды для научно-исследовательских целей в количестве от 1 мг до 10 гр.
  • Длина пептидов от 2 до 50 ак. (Стоимость синтеза пептида менее 6 ак рассчитывается как 6 ак, стоимость синтеза пептида более 30 ак оговаривается отдельно) – Ниже приведен калькулятор стоимость пептидов.
  • Возможны практически любые модификации пептидов: ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, миристилирование, ацетилирование, включение D-аминокислот, присоединение флюоресцентного красителя (ФИТЦ), присоединение хромогенных группировок, замыкание дисульфидных связей (до 2-х различных), стоимость оговаривается отдельно
  • Конъюгирование пептидов с белками носителями (KLH, БСА, MAP, др) – 15000 руб (до 5 мг)
  • Синтезированные пептиды поставляются с паспортом, содержащим данные аналитической ОФ-ВЭЖХ и данные масс-спектрометрии.
  • Срок синтеза и анализа не модифицированного пептида составляет 20-50 рабочих дней.
  • Предоставляем существенные скидки при заказе синтеза длинных пептидов, нескольких пептидов (от 2 и более), крупномасштабном синтезе пептидов (1-10 гр).
  • Для Вашего удобства мы составили «Рекомендации по хранению и растворению лиофилизированных пептидов».

Ниже находится удобный калькулятор для расчета стоимости синтеза пептидов с учетом необходимой длины пептида, количества и чистоты

Расчет стоимости синтеза пептида:

Цена пептида: 0 руб.
Напишите или позвоните нам, чтобы обсудить ваши исследования —
мы подберем оптимальное решение вашей задачи в соответсвии с мировой практикой и доступным бюджетом:

Синтез пептидов

Выделяют несколько основных типов синтеза пептидов:

  • Жидкофазный (классический) синтез пептидов,
  • Ферментативный синтез пептидов,
  • Твердофазный синтез пептидов.

ТТвердофазный синтез имеет ряд преимуществ, во-первых, поскольку на каждой стадии продукт реакции является полимером, то, обладая пониженной растворимостью, легко очищается (отмывается) от реагирующих веществ, а реагенты могут вводиться в избытке. Во-вторых, твердофазный синтез успешно поддается автоматизации. В — третьих возможен большой выход продукции за короткое время.

Твердофазный синтез пептидов предложен Р. Б. Меррифилдом из университета Рокфеллера (Нобелевская премия 1984 г.) Этот метод основан на сборке пептида на нерастворимой полимерной подложке последовательным присоединением остатков аминокислот с защищенными α -амино- и боковыми группами. Полимерная смола на основе 2-хлортритилхлорида, использовать которую впервые предложил K. Барлос, неустойчива к действию кислот. Пространственное строение полимерной смолы, равно как и умеренная кислотность, необходимая для разрыва связей в цепях, делают смолу полезной для множества применений. Для N-α -защиты аминокислот используют Fmoc-группу, неустойчивую к действию оснований. После удаления этой защитной группы следующую защищенную аминокислоту добавляют с использованием или связывающего реагента, или предварительно активированного защищенного производного аминокислоты. Конечный пептид присоединен к полимерной матрице через свою C-терминальную группу, причем связь с полимером можно расщепить, получив кислоту или амид (в зависимости от использованного связывающего реагента).Часто для защиты боковых цепей выбирают такие группы, расщепление которых проходит одновременно с отрывом пептида от полимерной матрицы.

Наиболее часто применяемыми защитами аминогруппы в твердофазном органическом синтезе являются защитные группы карбаматного типа трет-бутоксикарбонильная (Boc) и 9H-флуоренилметоксикарбонильная защита (Fmoc). Выбор защитной группы определяется используемым типом полимерного носителя. Условия иммобилизации защищенных аминокислот различны для различных типов полимерных носителей. Иммобилизация Boc-аминокислот на смолу Меррифильда, представляющую собой хлорметилированный полистирол, проводится in situ в виде цезиевых солей при добавлении суспензии карбоната цезия в диметилфталате (DMF) и каталитических количеств йодида калия. Избыток реагентов по отношению к количеству носителя выбирается в каждом случае индивидуально и составляет 1,5—4 эквивалента. Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ванга с образованием сложноэфирного линкера бензильного типа осуществляется карбодиимидным методом при помощи диизопропилкарбодиимида (DIC) в присутствии 4-(диметиламино)пиридина (DMAP) в качестве катализатора. Реакция иммобилизации со стерически незатрудненными аминокислотами протекает при комнатной температуре. Иммобилизация стерически затрудненных аминокислот требует проведения реакции при 40—60 °С в течение 2-х дней и повторного проведения. Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ринка с образованием амидного линкера бензгидрильного типа осуществляется в присутствии реагента Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол -1-илокси) трис-(диметиламино) фосфония гексафторфосфата (BOP), основания диизопропилэтиламина (DIEA) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt), в качестве катализатора. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 2 ч для стерически незатрудненных и 4-6 ч в случае стерически затрудненных аминокислот.

Преимуществом использования Fmoc — аминокислот являются более мягкие условия синтеза, в частности для пептидов подверженных кислото-катализируемым реакциям, например, с высоким содержанием триптофана. Одним из примеров преимущества синтеза и использованием Fmoc -аминокислот является синтез грамицидина А. Это пептид, содержащий 4 остатка триптофана. Синтез с использованием Boc- аминокислот давал выход продукта до 24%, при использовании Fmoc -аминокислот выход составил до 87%.

Эффективный процесс твердофазного синтеза во многом зависит от правильного выбора различных условий его проведения, таких как выбор смолы, растворителя и кинетики проведения синтеза. Эти переменные влияют на степень набухания смолы и связи ее с аминокислотами, количеству связывающих сайтов, что в конечном итоге влияет на синтез пептида в целом.

Производственный процесс (до 10 гр) синтеза пептидов включает в себя следующие этапы:

  • Синтез (твердая фаза) пептида на смоле
  • Отщепление пептида от смолы с удалением боковых защитных групп
  • Очистка и превращение пептида в ацетатную форму
  • Лиофилизация полученного продукта и его упаковка

Общая схема синтеза представлена ниже:

Синтез
Отщепление
Очистка
Лиофилизация

К основным исходным материалам относятся производные аминокислот, смолы, химические вещества и растворители.

Критические этапы процесса включают в себя проверку завершения реакций во время синтеза, а также проверку чистоты после отщепления и в течение и после очистки (в соответствии с таблицей).

Таблица — Критические этапы процесса синтеза

Критические этапыКонтроль процессаКритерии приемлемостиКомментарии
Синтез - после каждоо присоединения аминокислотыНингидриновый тестОтрицательныйПроверка свободных аминогрупп. Отрицательный тест показывает, что реакция прошла
Синтез - после каждоо удаления защитной группы FmosНингидриновый тестПоложительныйПроверка дпротекции. Положительный тест свидетельствует об эффективном удалении защитных групп
Отщепление - технический пептидОценка чистоты ВЭЖХ>20%Контроль примесей и общего выхода

Синтез осуществляем по методике твердофазного синтеза описанного Меррифилдом. В данном методе альфа -аминогруппы каждой аминокислоты защищены Fmoc — группой. Функциональные группы боковой цепи также защищены с использованием различных подходящих защитных групп. Пептидную цепь формировали с путем дериватизации С-концевой аминокислоты на подложке из смолы. Для этого соответствующее количество Fmoc-АА– Wang смолы переносили в реакционный сосуд подходящего размера, снабженный механической мешалкой. Смоле давали набухать в ДМФ (примерно 10 мл на 1 грамм смолы) в течение не менее двух часов до слива ДМФ. После чего смолу промывали несколько раз, как показано на блок-схеме (рисунок 83). N-концевые защитные группы (то есть Fmoc-группы) удаляли (стадия деблокирования) обработкой 20% пиперидином в ДМФ. Затем смолу промывали ДМФ, и каждая аминокислота в последовательности индивидуально соединялась в присутствии HOBt и DIC. Обычно для связывания использовали 2,5 — 3,5 молярных эквивалента Fmoc-аминокислоты (Fmoc-AA-OH) относительно синтетической шкалы. Fmoc-AA-OH и HOBt растворяли в ДМФ и активировали добавлением DIC в молярном отношении Fmoc-AA-OH/HOBt/DIC = 1,0/1,0/1,0 (допустимое отклонение ± 10%). Завершение каждой реакции контролировали качественным тестом Кайзера (нингидриновый тест). Если соединение было не полным, то вторичное соединение с той же аминокислотой проводили методом HBTU. Обычно для связывания использовали 2,5 — 3,5 молярных эквивалента Fmoc-AA-OH относительно синтетической шкалы. Fmoc-AA-OH, HBTU и HOBt растворяли в ДМФ и активировали путем добавления основания NMM, в молярном отношении Fmoc-AA-OH/HBTU/HOBt/Base = 1.0/0.95/1.0/2.0 (допустимое отклонение ± 10%) Если вторичное присоединение было неполным, то третье связывание с той же аминокислотой проводили с использованием метода PyBOP. Обычно для связывания использовали 2,5 — 3,5 молярных эквивалента Fmoc-AA-OH относительно синтетической шкалы. Fmoc-AA-OH, HOBt и PyBOP растворяли в смеси ДМА и ДМСО (1:1 об./об.) и активировали путем добавления основания DIPEA, в молярном отношении Fmoc-AA-OH/HOBt/PyBOP/основание = 1.0/1.0/1.0/2.0 (допускается отклонение ± 10%). Когда полная пептидная последовательность была синтезирована, пептидную смолу деблокировали и тщательно промывали последовательными промывками ДМФ и МеОН. После смолу высушивали под вакуумом в течение не менее 3 часов и до тех пор, пока последовательные измерения массы не изменялись более чем на 0,5.

Блок-cхема твердофазного синтеза пептидов
Блок-cхема твердофазного синтеза пептидов

Отщепление пептида от смолы

По окончании синтеза производят отщепление пептида от смолы с использованием TFA (трифторуксусную кислоту). В течение процесса удлинения пептида боковые цепи некоторых аминокислот должны быть защищены для предотвращения побочных реакций. Процесс расщепления удаляет все защитные группы и отщепляет пептид целиком от твердой поддерживающей смолы для его последующего выделения и очистки. Для пептидных смол, полученных с использованием Fmoc, TFA обычно используют для одновременного отщепления пептида от твердого носителя и удаления защитных групп на боковых цепях аминокислотных остатков. Результатом такого расщепления является получение реакционноспособных продуктов без защитных групп боковой цепи. Добавление таких веществ как фенол, тиоанизол, EDT и вода в TFA, минимизирует побочные реакции. После расщепления TFA технический пептид выделяют путем его осаждения эфиром из раствора для отщепления. Чистоту полученного материала проверяют с помощью обратно фазовой ВЭЖХ и сравнивают с критериями приемлемости, предусмотренными в протоколе серийного производства. Подтверждение подлинности пептида проверяют с помощью LC-MS.

Для отщепления пептидов от смолы готовили коктейль на основе TFA (8-12 мл коктейля на 1 грамм смолы). Для работы коктейль TFA (смесь TFA, воды, фенола, тиоанизола и EDT в соотношении 10 мл: 0,5 мл: 0,75 г: 0,5 мл: 0,25 мл) охлаждали на ледяной/водяной бане в течение 30 минут. В то же время, пептидную смолу переносили в контейнер соответствующего размера и также охлаждали на ледяной/водяной бане в течение 30 минут. После чего охлажденную пептидную смолу добавляли к коктейлю с TFA. Как только их объединяли, ледяную/водяную баню убирали и реакционную смесь перемешивали при 25 ± 5°С в течение 2 — 3 часов. Смешивание коктейля и смолы проводили в стеклянной бутылке соответствующего размера, снабженной механической или магнитной мешалкой. Затем реакционную смесь фильтровали через крупный стеклянный фильтр и смолу дважды промывали, используя на 1 промывку 0,5-1,0 мл TFA на грамм смолы. Собранные фильтраты объединяли, а смолу выбрасывали. Чтобы осадить расщепленный пептид, к полученному фильтрату добавляли холодный эфир из расчета на 1 мл фильтрата 10 мл охлажденного эфира, который предварительно охлаждали в течение 30 минут. Затем смесь эфира и пептида доводили до комнатной температуры в течение минут. Осажденный пептид фильтровали, используя стеклянный фильтр среднего размера. Осадок тщательно промывали холодным эфиром 3 раза, используя необходимое количества эфира для покрытия всего осадка на фильтре. После промывки эфир фильтровали через такой же стеклянный фильтр среднего размера. Затем пептид переносили в контейнер для сушки и сушили не менее 12 часов, пока последовательные измерения массы не изменялись более чем на 0,5%. После сушки технический пептид

Схема отщепления пептида от смолы
Схема отщепления пептида от смолы

Очистка и превращение пептида в ацетатную форму

Первой стадией очистки является первоначальная или грубая очистка. Технический пептид растворяют, фильтруют и очищают методом препаративной ВЭЖХ,с использованием обратно фазовой колонки С18. Буферную систему TFA используют для элюирования и очистки пептида с колонки С18. Это требует нескольких инъекций неочищенного пептида на колонку. Оценку чистоты фракций после первичной очистки оценивают с помощью аналитической ВЭЖХ. Полученные фракции пулируют на основе критериев пулирования (таблица). После грубой очистки процесс переходит на вторую стадию очистки, которая называется рециркуляционной очисткой. Фракции,не соответствующие критериям объединения основного пула (MainPool), рециркулируют с помощью препаративной ВЭЖХ до тех пор, пока чистота пептида не будет соответствовать критериям чистоты основного пула. Это требует нескольких инъекций пептида на колонку. Такая процедура должна выполняться в каждом пулах, пока они не будут соответствовать принятым критериям чистоты. Третьей стадией очистки является этап концентрации и солевого обмена. Основной пул вводят на колонку С18, затем промывают раствором с высокой концентрацией ацетатной соли для превращения пептида в форму ацетатной соли. Затем пептид элюируют из колонки буферной системой уксусной кислоты для получения конечного пула ацетата.

Таблица — Критерии для пулирования

Название пулаНазвание пула
«Further Pool» будущий пул80%<чистота<96%
«OT Pool» ОТ пул50%<чистота<80%
«Main Pool» основной пул>96%
«Ac Pool» ацетатный пул>96%
Чистота целевой ВЭЖХ до лиофлизации>98.2%

Для препаративной очистки методом ВЭЖХ пептид полученный в результате реакции отцепления растворяли и фильтровали через стекловолоконный фильтр размером 1 мкм. Отфильтрованный раствор пептида загружали в препаративную обратно фазовую колонку C18 для ВЭЖХ заполненную смолой под контролем препаративной системы ВЭЖХ (VARAR HPLC). После инъекции пептида на колонку С18 ее промывали буфером «J» (0,1% TFA в H2O — 1: 1000 (об./об.)) и буфером «K» (0,1% TFA в ACN — 1: 1000 ( об/об)). После чего элюировали и очищали пептид с колонки с использованием линейного градиента буфера «J» и буфера «K».

Фракции собранные с препаративной колонки во время первичной очистки, анализировали методом ВЭЖХ. Проверку чистоты проводили на аналитической колонке Kromasil C18, 5 мкм. Фракции полученные после первичной очистки пулировали в соответствии с критериями пулирования. Фракции, которые удовлетворяли требованиям чистоты основного пула, объединяли для следующего этапа очистки. Фракции, которые не соответствовали критериям объединения основного пула, отправлялись на доочистку. Пулы рециркулировали через препаративную ВЭЖХ колонку и очищали буфером «J» и буфером «K» до тех пор, пока пептид не начинал соответствовать критериям чистоты основного пула. Чистоту фракций контролировали аналитической ВЭЖХ.

После завершения очистки основной пул вводили в колонку C18, уравновешенную буфером «C» (1% TEA (об. / Об.) + 1% H3PO4 в H2O — 1:1:100 (об./об./об.)) и буфером «D» [20% буфера «C» в ACN — 20:80 (об./об.)]. Сначала колонку промывали буферами «С» и «D» , после чего промывали буфером «L» (0,5 М ацетата аммония в H2O) для превращения пептида в форму ацетатной соли. Затем пептид элюировали с колонки буфером «E» (0,3% уксусной кислоты в H2O) и буфером «F» (0,3% уксусной кислоты в ACN) для получения конечного ацетатного пула «Ac Pool». Чистоту конечного ацетатного пула проверяли методом аналитической ВЭЖХ в процессе, после чего его замораживали и лиофилизировали.

Схема очистки представлена на рисунке ниже.

Схема очистки пептидов
Схема очистки пептидов

После стадии очистки пептиды лиофилизировали с использованием сублимационной сушки Расфасованные пептиды хранили при температуре -20°C

Напишите или позвоните нам, чтобы обсудить ваши исследования —
мы подберем оптимальное решение вашей задачи в соответсвии с мировой практикой и доступным бюджетом:

Поиск по сайту