Компания ООО «Иннова плюс» с помощью уникального метода «Антивеномика 3 поколения» провела доклиническое исследование препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной» производства НПО «Микроген». В ходе работы мы выяснили насколько эффективно препарат нейтрализует яд гадюки Vipera berus berus, обитающей на территории России, а также его основные токсические активности. Кроме этого, мы определили какие компоненты яда нейтрализуются препаратом, а какие нет, и сколько на самом деле нужно ввести препарата пациенту, чтобы полностью нейтрализовать все токсические активности яда гадюки.
В настоящее время в Российской Федерации существует только одно противоядие против яда гадюки, производства НПО «Микроген», которое было зарегистрировано еще в СССР. Свежие данные помогут врачам-токсикологам в правильном выборе необходимого количества противоядия, а производителю позволят значительно улучшить технологию получения субстанции препарата путем оптимизации схемы иммунизации лошадей. Разработанный подход для изучения сыворотки, основанный на методе антивеномики 3 поколения в сочетании с тестированием на животных, позволяет эффективно проводить доклинические исследования, а также сравнивать препараты разных производителей.
Для оценки нейтрализующей активности препарата изучали его влияние на летальную, геморраргическую и фосфолипазную активности яда гадюки Vipera berus berus. Нейтрализующая способность сыворотки по отношению к летальной активности яда составила 3.1 (1.5-4.7) мг яда/мл препарата, геморраргической – 8.0±0.1 мг яда/мл препарата и фосфолипазной – 1.70±0.06 мг яда/мл препарата.
Определение связывающей активности сыворотки проводили с помощью методов антивеномики 3 поколения. Для этого на первом этапе мы изучали белковый состав яда. Неочищенный яд разделяли на фракции с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Полученные фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле для разделения белков и пептидов по весу в диапазоне от 6 до 116 кДа. После электрофореза полосы из геля вырезали, обрабатывали трипсином и анализировали методом масс-спектрометрии. Проанализировав полученные данные, мы увидели, что протеом яда гадюки Vipera berus berus обитающей на территории России содержит все основные семейства токсинов. Самую большую группу составляют PLA2 — 25,3%, в которой преобладают по меньшей мере 18 D49-PLA2 — 20,6% и одна S49-PLA2 4,7%. Другими семействами токсинов являются SVMP (17,2%), SVSP (16,2%), BPP (9,5%), CRISP (8%), C-NAP (7,8%) и LAO (7,3%), KUN (2.6 %), Disintegrin (1%), VEGF, CTL (2%).
На втором этапе исследования анализировали какое количество яда может связать препарат. Для этого через колонку с аффинным сорбентом, к которому пришивали 10 мг препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной» пропускали фракции с ядом, полученные в результате обращенно-фазовой хроматографии, и смотрели какие компоненты яда и в каком количестве будут связываться с колонкой. В качестве контроля использовали IgG лошади. Оказалось, что анализируемый препарат способен связывать всего 3.28 мг яда (60,2%), что связано с тем, что всего 6.24% молекул препарата представляют собой токсин-связывающие антитела, 60% из которых являются нейтрализующими.
С помощью полученных данных можно рассчитать номинальную эффективность противоядия, что необходимо для выбора правильной дозы препарата при лечении отравления. Принимая в расчет то, что нейтрализующая активность препарата составляет 2,3 мг яда/ мл препарата, а количество яда, вводимого при укусе гадюкой 10-18 мг – для лечения отравления потребуется 4-8 ампул противоядия.
В России рекомендуемое лечение проводится по методу Безредки, при котором сначала больному подкожно в место укуса вводят 0.1 мл противоядия и, если через 10–15 минут нет признаков побочной реакции, вводят еще 0.25 мл, а затем через 15 минут оставшуюся часть ампулы. В больнице лечение назначается в зависимости от тяжести отравления. При легком отравлении пациенту внутримышечно вводят 1-2 ампулы, а при тяжелом 4-5 ампул. В особо тяжелых случаях рекомендуется внутривенное введение противоядия, разведенного 1/5–1/10 в физиологическом растворе.
Эксперименты in vivo позволяют определить среднюю эффективную дозу (EД50) препарата, необходимую для получения информации о количестве противоядия (или соотношении дозы яда/противоядия), необходимого для выживания 50% протестированных животных. Однако, проведение экспериментов по нейтрализации in vivo не дает информации, о том какие именно токсины эффективно нейтрализуются антителами, а какие нет. Более того, иммуноглобулины класса G из нормальных и гипериммунных сывороток неразличимы химически и структурно. Количественная оценка содержания антител против токсинов редко определяется на этапе доклинической оценки противоядия. Получение таких знаний позволит провести более полный и точный анализ противоядия, а также сравнить противоядия разных производителей, с целью увеличения их эффективности.
Так, к примеру, мы сравнили эффективность препарата ViperaTAbTM производства MicroPharm, применяющегося при укусах гадюкой, и препарата производства Микроген. Препарат ViperaTAbTM представляет собой очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела овцы (20 мг Fab/мл) и обладает нейтрализующей активностью равной 597ЛД50/мл. Номинальная нейтрализующая способность препарата равна 29,85ЛД50 на 1 мг Fab. Препарат производства Микроген не подвергался аффинной очистке, в результате чего его нейтрализующая способность составляет всего 116ЛД50/мл (в 1 мл препарата содержится 120 мг F(ab’)2). За счет того, что всего 6.24 % антител входящих в состав препарата являются антителами против токсинов, ее нейтрализующая активность составляет 0,97 ЛД50/мг F(ab’)2, что значительно ниже аналогичной, производства MicroPharm. Аффинная очистка препарата может увеличить его нейтрализующую активность до 15,5 ЛД50/мг F(ab’)2. Также, более низкая нейтрализующая способность сыворотки производства Микроген связана с тем, что процедура иммунизации лошадей недостаточно эффективна.
Таким образом, использование нового протокола иммунизации, а также аффинного способа очистки антител при производстве препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной» может увеличить его нейтрализующую способность до 52%, что будет сопоставимо с нейтрализующей способностью препарата ViperaTAbTM. При этом на порядок уменьшится количество чужеродного белка в препарате и соответственно уменьшаться возможные аллергические реакции на препарат у пациентов.
Для исследования, проводимого Казанским федеральным Университетом (группа Константина Петрова), с участием генерального директора ООО «Иннова плюс» Аль-Шехадат Р.И. ("Schwann Cells Sense and Control Acetylcholine Spillover at the Neuromuscular Junction by α7 Nicotinic Receptors and Butyrylcholinesterase"), был синтезирован пептид DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI для индукции экспериментальной аутоиммунной модели миастении (EAMG).
Специалисты компании ООО «Иннова плюс» представили метод биотестирования, основанный на автоматизированной регистрации двигательной активности группы фибропластов человека с использованием голографической микроскопии. Показали чувствительность тест-системы к действию низкоинтенсивного электромагнитного излучения диапазона ультравысоких частот.
С участием генерального директора ООО «Иннова плюс» Аль-Шехадат Р.И. в 2019 году в журнале "Vaccine" вышла статья об увеличении спонтанных viral blips (скачков вирусной нагрузки) у некоторых участников II фазы клинического испытания терапевтической ДНК вакцины против ВИЧ.
Специалистами компании ООО «Иннова плюс» в ходе доклинического исследования лекарственного препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной», зарегистрированного в Российской Федерации, было впервые показано, что данный препарат является эффективным не только против яда гадюки Vipera berus, но и против яда гюрзы Macrovipera lebetina.