Разработка генетических конструкций.
Синтез генов

Кодоновый состав генетических конструкций

Параметр «CAI» – индекс адаптации кодонов рассчитывается как произведение отношений частоты встречаемости в геноме каждого присутствующего в последовательности кодона к частоте встречаемости в геноме наиболее частого синонимичного кодона, кодирующего ту же аминокислоту, т.е. показывает адаптацию белок-кодирующей последовательности по частотам синонимических кодонов. CAI близкий к 1 говорит об использовании наиболее оптимальных кодонов и отсутствию редких кодонов, что приводит к увеличению экспрессии целевого гена.

Под редкими кодонами понимаются кодоны, используемые клетками c частотой менее 1%. Частота встречаемости кодонов (кодоновое предпочтение) напрямую влияет на размер пула тРНК, который связан с эффективностью, скоростью и правильностью трансляции целевого гена. Исследования показывают, что даже 3% уровень содержания редких кодонов, кодирующих аргинин (AGA/AGG), негативно сказывается на уровне синтеза целевого рекомбинантного белка, а присутствие таких кодонов в тандеме может приводить к сдвигу рамки считывания, преждевременной терминации и низкой эффективности трансляции.

Тем не менее, не всегда искусственное доведение CAI до единицы позволяет достичь более высоких степеней экспрессии. Это связано, во-первых, с тем, что сильно транскрибируемые мРНК будет высокая концентрация кодонов для ограниченного набора тРНК, что приведет к несбалансированному пулу тРНК, дисбалансу использования паттерна кодонов и потенциалу для ошибок трансляци. Во-вторых, отсуствует гибкость в выборе кодонов, что неизбежно приведет к появлению повторяющихся элементов, вторичных структур в мРНК и как следствие нестабильности конструкции, ингибированию связывания мРНК с рибосомами. Кроме того, повторяющиеся элементы могут представлять затруднения при их синтезе.

Термодинамическая и ферментативная стабилизация структуры мРНК

GC-состав, количество CpG последовательностей и их распределение напрямую влияет на термодинамическую стабильность мРНК целевого гена. У дрожжей была установлена строгая корреляция между пониженной термодинамической стабильностью мРНК и количеством редких кодонов. Увеличенное количество CpG последовательностей и высокий GC-состав целевого гена приводят к увеличению термодинамической стабильности мРНК и увеличению уровня экспрессии гена. В то же время повышенное количество UpA-динуклеотидов, являющихся предпочтительной целью для рибонуклеазы Е, негативно влияет на стабильность мРНК. И хотя CpG динуклеотиды легко подвергаются мутациям [86] и участвуют в сайленсинге генов на уровне ДНК, количество внутригенных CpG прямо коррелирует с частотой транскрипции de novo.

Во многих вирусных генах наблюдается повышенное содержание нуклеотидов АТ по сравнению с предпочтением клеток млекопитающих к GC-богатым кодонам. Замена кодонов на синонимичные, более GC-богатые, повышало стабильность некоторых мРНК ВИЧ на несколько порядков.

Идеальные значения GC состава составляют 30-70%, пики, сильно выходящие за эти пределы, могут негативно влиять на транскрипционную и трансляционную эффективность.

Удаление криптических внутригенных сайтов сплайсинга

Эукариотический геном содержит большое количество так называемых криптических сайтов сплайсинга. Криптические сайты сплайсинга не работают либо работают на низком уровне до тех пор, пока существующие сайты сплайсинга не будут нарушены мутациями (Padgett et al., 1986; Green, 1986). При активации они могут быть весьма эффективными, что является причиной многих генетических заболеваний (Buratti et al., 2011; Wang & Cooper, 2007). Таким образом, криптические сайты подавляются близлежащими сильными сайтами сплайсинга. Этот факт приводит нас к выводу о существовании конкуренции за факторы сплайсинга между различными сайтами (Padgett et al., 1986; Green, 1986).

Исходя из вышесказанного, существующие программы распознавания сайтов сплайсинга можно использовать для распознавания криптических сайтов. При этом последние будут иметь меньшую достоверность, чем канонические сайты сплайсинга.

Удаление предварительных поли(А) сайтов

Полиаденилирование – это добавление поли(А) хвоста к матричной РНК. Поли(А) хвост состоит из множества аденозин монофосфатов. В эукариотах, полиаденилирование является частью созревания зрелой мРНК и необходимо для ее трансляции.

33конец вновь синтезированной пре-мРНК первоначально нарезается комплексом белков. Далее эти белки добавляют остатки аденозина к 3’концу мРНК. В некоторых генах, например, PGC-1α, один ген содержит несколько сайтов полиаденилирования. В результате этого с одного гена возможна транскрипция сразу нескольких транскриптов, как и в результате альтернативного сплайсинга.

Поли(А) хвост необходим для экспорта мРНК из ядра, трансляции и стабильности мРНК. С течением времени хвост укорачивается, и, когда он становится чересчур коротким, мРНК энзиматически расщепляется.

Полиаденилирование мРНК осуществляется и в бактериях, однако при этом поли(А) хвосты короче, меньшее количество РНК подвергается полиаденилируется, и это способствует деградации мРНК.

При существовании альтернативных сайтов полиаденилирования мРНК различаются по 3’концу, в том числе 3’нетранслируемому району (UTR), который часто содержит сайты связывания миРНК. Иногда альтернативные сайты сплайсинга изменяют содержание кодирующего района мРНК, но гораздо чаще они приводят к укорочению UTR.

Преждевременное полиаденилирование мРНК ослабляет экспансию человеческих ретратранспозонов LINE-1s. Появление непредусмотренных альтернативных сайтов полиаденилирования приводит к появлению абберантных мРНК и, как следствие, уменьшению или даже полному отсутствию экспрессии целевого белка в генноинженерных экспериментах. К примеру, присутствие преждевременного сайта полиаденилирования приводит к низкой экспрессии гена cry3Ca1 Bacillus thuringiensis в растениях трансгенного картофеля, гликозид-гидролазы Reticulitermes speratus (эндосимбионта термитов) в Aspergillus oryzae, химерного белка CAB-2 в линии клеток CHO-K1.

Удаление внутренних сайтов связывания для рибосом

При трансляции, мРНК служит, во-первых, платформой для сборки рибосомы (инициация), затем как матрица для синтеза белка (элонгация), и наконец, как конец белок-кодирующей последовательности и диссоциации рибосомы (терминации). В эукариотах, большинство инициаций трансляций осуществляется комплексом, сборка которого требует модифицированного нуклеотида – кэпа – на 5’конце мРНК. Распознование кэпа ведет к связыванию эукариотического фактора инициации (eIF) и малой (40S) субъединицы рибосомы, которые затем сканируют мРНК в поисках подходящего стартового кодона. Далее рекрутируется большя (60S) субъеденица рибосомы. Этот каноничекий кэп-зависимый и скан-зависимый процесс инициации не соблюдается для всех белков в эукариотической клетке – инициация трансляции может происходить и кэп-независимым путем. При этом сама последовательность мРНК рекрутирует трансляционный комплекс, часто не требуя многих eIF. Такой, кэп-независимый путь называется «внутренней инициацией трансляции», а отвечающая за него последовательность называется «сайтом вхождения рибосом», или IRES.

IRES встречается у многих РНК-вирусов, например вируса гепатита С, вируса гепатита А, ВИЧ, пикарновирусов, вируса саркомы Рауса и т.д. Также, некоторые клеточные белки также содержат IRES: инсулиноподобный ростовой фактор 2, FGF-1, HIF-1α, Bcl-2, Apaf-1, c-myc, p53, eIF4G и т.д. Вторичная структура некоторых IRES представлена на рисунке 9.

Нахождение в составе генотерапевтических конструкций непредусмотренных последовательностей IRES может привести к инициации транскрипции с некорректного стратового кодона, что приведет к экспрессии укороченного с N-конца белкового продукта, либо к сдвигу рамки считывания. Все это вместе может привести к уменьшению экспрессии целевого белка и потому нежелательно.

Добавление регуляторных и прочих элементов

Сайты рестриктаз, Промоторы, сайты посадки транскрипционных факторов, Последовательность Козак, Cигнал полиаденилиирования, интроны.

Основы метода.

Расчет последовательностей олигонуклеотидов проводим с использованием программы Gene2Oligo. Программа позволяет разбить последовательность гена, которую необходимо синтезировать, на небольшие уникальные олигонуклеотиды, с помощью которых удается получить четко заданную последовательность гена, минимизировав вероятность получения мутаций и других ошибок синтеза.

Для синтеза длинных генов целесообразно разбивать ген на фрагменты до 1 kb. Ввиду ошибок в процессе синтеза, вероятность получения правильной последовательности после сборки уменьшается при увеличении длины. Разбивка последовательности гена на более короткие фрагменты увеличивает вероятность получения правильной последовательности и расчета более равномерной температуры плавления (Tm) для набора олигонуклеотидов, а также делает возможным параллельный синтез различных генов при одной температуре.

Имея универсальную Tm для всего множества олигонуклеотидов, можно осуществлять сборку с использованием лигазной цепной реакции (LCR) или полимеразной цепной реакции (ПЦР) при температуре ближе к средней Tm, не влияя отрицательно на гибриды с более низкой Tm. При более высокой температуре несоответствия имеют более сильный дестабилизирующий эффект, который уменьшает вероятность включения мутантных олигонуклеотидов в конечный продукт.

Однако важно использовать именно диапазон температур: при слишком узком диапазоне Tm, например, ± 1°C, нет практически никаких шансов получить набор олигонуклеотидов. Различие на 3-4°C является оптимальным.

Указывали имя последовательности и саму последовательность, ориентированную от 5 ‘-конца к 3’-концу. Выбирали между тремя режимами дизайна: в основе калькуляции – длина последовательности, с оптимизированным программой Tm, либо — Tm, если необходимо сосредоточить внимание на определенной температуре, третий режим просто позволяет разрезать последовательность. Одновременная установка размера блока гибридизации, Tm в режиме приоритета длины требует особого внимания, чтобы избежать выбора взаимоисключающих значений. Например, нет возможности получения любых олигонуклеотидов, если выбранная температура слишком высокая или слишком низкая для данного размера олигонуклеотида (например, длина 15 nt и Tm 80°С не совместимы).

Устанавливали концентрацию ДНК и натрия в соответствии с условиями эксперимента, используемыми во время сборки. Изменение данных параметров влияет на вычисление Tm. Нет гарантии получения того же набора олигонуклеотидов при использовании различных концентраций ДНК или соли.

Расчет последовательностей олигонуклеотидов

Последовательность гена, и кодирующую цепь, и антисмысловую, разбивали на олигонуклеотиды с использованием программы Gene2Oligo. Олигонуклеотиды подбирали таким образом, чтобы их концы перекрывались олигонуклеотидом комплементарной цепи.

Все олигонуклеотиды имели схожие термодинамические свойства (температура плавления, Tm, различалась на 3°C) для обеспечения равномерной гибридизации в процессе сборки и были очень специфически подобраны, чтобы избежать неправильной сборки.

Длина каждого олигонуклеотида составила около 50-100 п.н. Олигонуклеотиды синтезировали с использованием твердофазного синтеза.

Синтез гена. Описание параметров

Поскольку размер олигонуклеотида динамичен и модифицируется в ходе проектирования, первый шаг заключался в добавлении короткой заглавной и следовой последовательности к исходной последовательности, что обеспечивало более высокую степень свободы при выборе олигонуклеотидов. Первый и последний олигонуклеотиды не обязательно должны были начинаться и заканчиваться на обоих концах исходной последовательности. Эти дополнительные последовательности удаляли в процессе окончательной ПЦР-амплификации путем тщательного подбора ПЦР-праймеров.

Конструировали олигонуклеотиды в пределах ± 4 nt по среднему размеру. S — средний размер, l – общая длина исходной последовательности, включая последовательность перед и после исходной. Сначала вычисляли матрицу Tm для каждого положения исходной последовательности от 0 до l — (s — 4) и для гибридизационного блока длиной от s — 4 до s + 4. Затем вычисляли среднее значение всех Tm — Tm ср — значение по умолчанию в отсутствие определяемых Tm.

Для каждой позиции в пределах от 0 до l — (s + 4), для прямой и обратной цепи исходной последовательности, генерировали набор из «подцепей» длины s + 4, который использовали для создания доменной базы данных. Всю исходную последовательность затем проанализировали против базы данных с использованием инструмента WU-Blast для поиска сходства последовательностей.

WU-BLAST построен следующим образом: E5000 V1 W5 W5 B100000 gapS2 = 1 S2 = 1 hspmax = 0 warnings matrix = GT. Первые восемь опций установлены для представления любого выравнивания, охватывающего, по крайней мере, пять последовательных нуклеотидов, в то время как они не сообщают об описании одной цепи, что не имеет отношения к нашему случаю. GT матрица позволяет заменять G на А и Т на С без дополнительного значения, уделенного стабильному спариванию GT в ДНК (Allawi et al., 1998) Результат Blast анализировали для выявления соответствия олигонуклеотидов более чем одному региону исходной последовательности. Tm вычисляли для каждого предполагаемого олигонуклеотида перекрестной гибридизации любого размера, начиная от s – 4, s+ 4. Если Tm была выше порога, установленного на Tm Ср — 20, этот кандидат считали неспецифическим и сообщали об этом в матрице специфичности.

Затем строили матрицы длины путем разбора и Tm и матрицы специфичности. Для каждой позиции исходной последовательности от 0 до l — (s — 4) выбирали два олигонуклеотида, удовлетворяющих всем следующим условиям:

• Минимальный | Tm — Tm Ср |,
• Tm > Tm Ср — д Tm ,
• Tm < Tm Ср + д Tm ,

где д Tm является диапазоном Tm, определенным пользователем (или выбранным одним из четырех по умолчанию). Если об этих кандидатах не было указано, что они исключены из матрицы специфичности, то их размеры помещали в матрицу длины. Если ни один олигонуклеотид не был найден в данном положении, то это положение помечали как негодное в матрице длине.

Окончательный выбор олигонуклеотидов состоял из анализа матрицы длины, которая может рассматриваться как дерево. Чтение начинается в положении, соответствующем первой нуклеотидной последовательности, введенной в интерфейсе, за исключением заглавной последовательности. Длину первого олигонуклеотида считывали и использовали для указания начальной позиции следующего кандидата. Длина второго кандидата определяла начальное положение третьего кандидата, и так далее до конца исходной последовательности, пока она не был достигнута или до достижения негодного положения. В последнем случае возвращались на один шаг назад и брали второй лучший размер олигонуклеотида и проверяли, приводит ли это к правильному решению. Если нет, делали еще один шаг назад, чтобы изучить новые ветви «дерева». Можно было вернуться на всем пути в исходное положение и так изучить все возможные ветви «дерева». В худшем случае, когда не обнаруживали годный набор олигонуклеотидов, начинали процесс с первого основания заглавной последовательности (положения «-1» относительно начала исходной последовательности). Данную операцию повторяли до полного набора олигонуклеотидов или пока не доходили до конца заглавной последовательности. В последнем случае не существует решения, удовлетворяющего критериям проектирования.

Выбор режима.

• Режим приоритета длины.

В режиме приоритета длины можно выбрать средний размер для гибридизационного блока. По умолчанию программа использует Tm ср, рассчитанную для данного среднего размера и Tm ± 4°C для поиска набора олигонуклеотидов, удовлетворяющих всем условиям, описанным выше.

• Режим приоритета температуры плавления.

В этом режиме устанавливают значение для Tm ср и Tm. Программа автоматически вычисляет средний размер блока гибридизации, который приведет к ближайшим Tm к исходной Tm. После этого производят вычисления, описанные выше. Этот режим можно рассматривать как режим приоритета времени с использованием оптимального среднего размера для этой Tm.

• Режим основной нарезки.

Возможна обрезка последовательности в олигонуклеотиды равной длины. Нет оптимизации в режиме, позволяющем избежать неспецифической гибридизации между различными олигонуклеотидами или обеспечить хорошую однородность Tm. Заглавную последовательность не добавляют, используют только короткую концевую последовательность, чтобы получить правильный размер последнего олигонуклеотида.

Для синтеза гена интереса выбрали режим приоритета длины.

Выбор методик синтеза гена.

• ПЦР-сборка (Assembly PCR).

ПЦР-сборку проводят в объеме 50 мкл, содержащем 200 мкМ каждого дНТФ, 0,1 мкМ каждого олигонуклеотида, 0,5 ед Taq ДНК-полимеразы или 1 ед Pfu ДНК полимеразы в буфере, содержащем 2,5 мМ MgCl2. Осуществляют ПЦР-сборку: денатурируют при 95°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 95°С в течение 30 сек, 52°С в течение 30 сек и при 72°С в течение 1 мин, заканчивают инкубацию при 72°C течение 5 мин.

• Лигазная цепная реакция (LCR).

LCR проводят в конечном объеме 25 мкл, содержащем 0,1 мкМ каждого олигонуклеотидного фосфорилировали с использованием полинуклеотидкиназы Т4 и 10 единиц Taq ДНК-лигазы. LCR проводят следующим образом: 94°С в течение 2 мин, 40 циклов при 94°С в течение 30 сек, 51°С в течение 4 мин.

• Вторая ПЦР.

Полноразмерный продукт после LCR или сборки реакции ПЦР подвергают ПЦР-амплификации с использованием праймеров в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл смеси ПЦР-сборки или 5 мкл смеси LCR, 200 мкМ каждого дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 0,5 ед Taq ДНК-полимеразы или 1 ед Pfu ДНК полимеразы и буфер, содержащий 2,5 мМ MgCl2. ПЦР: денатурация при 95°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 95°С в течение 30 сек, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин, завершающая инкубация при 72°С в течение 5 мин.

После чего гены клонируют по сайту EcoRV в векторе pUC57 и проводят секвенирование вставки. При наличии небольших мутаций проводят их сайт-специфический мутагенез.