15 Ноябрь 2022
358
Абрамова О.А., Фомина Ю.А. Выделение МСК из пульпы молочных зубов и третьих маляров взрослого человека.
Одним из наиболее доступных источников мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) у детей являются ткани пульпы молочных зубов, выпавших естественным путем [1], в то время как у взрослого человека выделение ММСК возможно из пульпы третьих маляров [2].
Был проведен ряд экспериментов по выделению МСК из молочного зуба. Выпавший естественным образом резец молочного зуба был помещен в пробирку с транспортной средой (ООО «Иннова плюс»). Зуб доставляли в лабораторию в течение 2 часов. В лаборатории зуб деконтаминировали. Выделение клеток из пульпы зуба проводили ферментативным способом с использованием 0,5 % раствора коллагеназы II типа. Выделенные таким образом клетки переносили в культуральный фласк на специально подобранную питательную среду и помещали в CO2-инкубатор, инкубировали при 37 °C и 5 % CO2 в течение 24 часов.
Результаты. После проведения работ по выделению мезенхимальных стволовых клеток на следующий день были визуально зафиксированы отдельные выделенные фибробластоподобные клетки (Рисунок 1). Каждый день фиксировали новые зоны образования колоний.
Рисунок 1-Единичная прикрепившаяся клетка, увеличение в 20 раз
Рисунок 1-Единичная прикрепившаяся клетка, увеличение в 40 раз.
МСК из третьих маляров человека выделяли следующим образом. Удаленный хирургическим путем зуб помещали в стерильный пластиковый контейнер, содержащий 5 мл транспортной среды (ООО «Иннова плюс), помещали в термоконтейнер с температурой плюс 2-4 °С и доставляли в лабораторию. Далее зуб деконтаминировали раствором с антибиотиком-антимикотиком и выделяли клетки из пульпы зуба ферментативным способом с применением 0,5 % раствора коллагеназы II типа. Для этого, разрушенный в стерильных условиях при помощи специального прибора, зуб помещали в чашку Петри, извлекали пульпу и промывали пульпарную камеру зуба ферментативным раствором и далее инкубировали ткань в этом растворе в течение 1 часа при 37 °C на водяной бане. Выделенные таким образом клетки помещали в полную питательную среду на культуральные фласки 25 см2, далее инкубировали при 37 °C и 5 % CO2 для наращивания массы клеток и дальнейшего их изучения.
В течение нескольких дней наблюдали за появлением колоний МСК во фласке (Рисунок 2), меняя среду через день и проводя деконтаминацию 10 % раствором антибиотика при необходимости.
Рисунок 2 – Выделенные клетки из 3-го маляра
Далее клетки наращивали по достижении 100 % конфлюэнтности, снимали клеточный слой посредством обработки раствором трипсин-версена, нейтрализовали средой с сывороткой, производили подсчет клеток в камере Горяева, далее клетки центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и замораживали в криосреде, содержащей 90 % фетальной бычьей сыворотки и 10 % диметилсульфоксида.
Таким образом, данные протоколы транспортировки и выделения МСК из тканей молочных зубов и третьих маляров взрослого человека показали свою эффективность.
ЛИТЕРАТУРА:
