03 Март 2021
1464
По материалам статьи:
Ruslan I. Al-Shekhadat, Ksenia S. Lopushanskaya, Álvaro Segura, José María Gutiérrez, Juan J. Calvete, Davinia Pla. Vipera berus berus Venom from Russia: Venomics, Bioactivities and Preclinical Assessment of Microgen Antivenom // Toxins. — 2019, — №11(2), — P.90.
Компания «Иннова плюс» с помощью уникального метода «Антивеномика третьего поколения» провела доклиническое исследование препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной» производства НПО «Микроген». В ходе работы мы выяснили насколько эффективно препарат нейтрализует яд гадюки Vipera berus berus, обитающей на территории России, а также его основные токсические активности. Кроме этого, мы определили какие компоненты яда нейтрализуются препаратом, а какие нет, и сколько на самом деле нужно ввести препарата пациенту, чтобы полностью нейтрализовать все токсические активности яда гадюки.
В настоящее время в Российской Федерации существует только одно противоядие против яда гадюки, производства НПО «Микроген», которое было зарегистрировано еще в СССР. Свежие данные помогут врачам-токсикологам в правильном выборе необходимого количества противоядия, а производителю позволят значительно улучшить технологию получения субстанции препарата путем оптимизации схемы иммунизации лошадей. Разработанный подход для изучения сыворотки, основанный на методе антивеномики 3 поколения в сочетании с тестированием на животных, позволяет эффективно проводить доклинические исследования, а также сравнивать препараты разных производителей.
Для оценки нейтрализующей активности препарата изучали его влияние на летальную, геморраргическую и фосфолипазную активности яда гадюки Vipera berus berus. Нейтрализующая способность сыворотки по отношению к летальной активности яда составила 3.1 (1.5-4.7) мг яда/мл препарата, геморраргической – 8.0±0.1 мг яда/мл препарата и фосфолипазной – 1.70±0.06 мг яда/мл препарата.
Определение связывающей активности сыворотки проводили с помощью методов антивеномики 3 поколения. Для этого на первом этапе мы изучали белковый состав яда. Неочищенный яд разделяли на фракции с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Полученные фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле для разделения белков и пептидов по весу в диапазоне от 6 до 116 кДа. После электрофореза полосы из геля вырезали, обрабатывали трипсином и анализировали методом масс-спектрометрии. Проанализировав полученные данные, мы увидели, что протеом яда гадюки Vipera berus berus обитающей на территории России содержит все основные семейства токсинов. Самую большую группу составляют PLA2 — 25,3%, в которой преобладают по меньшей мере 18 D49-PLA2 — 20,6% и одна S49-PLA2 4,7%. Другими семействами токсинов являются SVMP (17,2%), SVSP (16,2%), BPP (9,5%), CRISP (8%), C-NAP (7,8%) и LAO (7,3%), KUN (2.6 %), Disintegrin (1%), VEGF, CTL (2%).
На втором этапе исследования анализировали какое количество яда может связать препарат. Для этого через колонку с аффинным сорбентом, к которому пришивали 10 мг препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной» пропускали фракции с ядом, полученные в результате обращенно-фазовой хроматографии, и смотрели какие компоненты яда и в каком количестве будут связываться с колонкой. В качестве контроля использовали IgG лошади. Оказалось, что анализируемый препарат способен связывать всего 3.28 мг яда (60,2%), что связано с тем, что всего 6.24% молекул препарата представляют собой токсин-связывающие антитела, 60% из которых являются нейтрализующими.
С помощью полученных данных можно рассчитать номинальную эффективность противоядия, что необходимо для выбора правильной дозы препарата при лечении отравления. Принимая в расчет то, что нейтрализующая активность препарата составляет 2,3 мг яда/ мл препарата, а количество яда, вводимого при укусе гадюкой 10-18 мг – для лечения отравления потребуется 4-8 ампул противоядия.
В России рекомендуемое лечение проводится по методу Безредки, при котором сначала больному подкожно в место укуса вводят 0.1 мл противоядия и, если через 10–15 минут нет признаков побочной реакции, вводят еще 0.25 мл, а затем через 15 минут оставшуюся часть ампулы. В больнице лечение назначается в зависимости от тяжести отравления. При легком отравлении пациенту внутримышечно вводят 1-2 ампулы, а при тяжелом 4-5 ампул. В особо тяжелых случаях рекомендуется внутривенное введение противоядия, разведенного 1/5–1/10 в физиологическом растворе.
Эксперименты in vivo позволяют определить среднюю эффективную дозу (EД50) препарата, необходимую для получения информации о количестве противоядия (или соотношении дозы яда/противоядия), необходимого для выживания 50% протестированных животных. Однако, проведение экспериментов по нейтрализации in vivo не дает информации, о том какие именно токсины эффективно нейтрализуются антителами, а какие нет. Более того, иммуноглобулины класса G из нормальных и гипериммунных сывороток неразличимы химически и структурно. Количественная оценка содержания антител против токсинов редко определяется на этапе доклинической оценки противоядия. Получение таких знаний позволит провести более полный и точный анализ противоядия, а также сравнить противоядия разных производителей, с целью увеличения их эффективности.
Так, к примеру, мы сравнили эффективность препарата ViperaTAbTM производства MicroPharm, применяющегося при укусах гадюкой, и препарата производства Микроген. Препарат ViperaTAbTM представляет собой очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела овцы (20 мг Fab/мл) и обладает нейтрализующей активностью равной 597ЛД50/мл. Номинальная нейтрализующая способность препарата равна 29,85ЛД50 на 1 мг Fab. Препарат производства Микроген не подвергался аффинной очистке, в результате чего его нейтрализующая способность составляет всего 116ЛД50/мл (в 1 мл препарата содержится 120 мг F(ab’)2). За счет того, что всего 6.24 % антител входящих в состав препарата являются антителами против токсинов, ее нейтрализующая активность составляет 0,97 ЛД50/мг F(ab’)2, что значительно ниже аналогичной, производства MicroPharm. Аффинная очистка препарата может увеличить его нейтрализующую активность до 15,5 ЛД50/мг F(ab’)2. Также, более низкая нейтрализующая способность сыворотки производства Микроген связана с тем, что процедура иммунизации лошадей недостаточно эффективна.
Таким образом, использование нового протокола иммунизации, а также аффинного способа очистки антител при производстве препарата «Сыворотка против яда гадюки обыкновенной» может увеличить его нейтрализующую способность до 52%, что будет сопоставимо с нейтрализующей способностью препарата ViperaTAbTM. При этом на порядок уменьшится количество чужеродного белка в препарате и соответственно уменьшаться возможные аллергические реакции на препарат у пациентов.
Полный текст: https://www.mdpi.com/2072-6651/11/2/90
