Получение одноцепочечных антител (HCAb) в верблюдах, альпаках, ламах и акулах

Создание штаммов-продуцентов наноантител / нанотел / sdAb

У представителей семейства Верблюдовых (верблюдов, лам, альпак) и у надотряда Акул случайно были обнаружены одноцепочечные антитела, содержащие только тяжелые цепи. Вариабельная область этих антител состоит всего из одного домена размером 13-15 кДа (single-domain antibody, sdAb) и проявляет все свойства классических полноразмерных антител класса IgG. Благодаря небольшому размеру, высокой гидрофильности и термической стабильности наноантител, они с высокой эффективностью воспроизводятся в клетках бактерий E. coli. Отобрав нужный нам вариант sdAb из иммунизированного верблюда Camelus dromedarium (Верблюд двугорбый) или акулы Scyliorhinus canicula (Кошачья акула обыкновенная), мы производим VHH и VNAR фрагменты антител методом фагового дисплея с последующим биопеннингом.

Мы производим VHH фрагменты антител верблюдов, лам, альпак, VNAR фрагменты антител акул

Применение наноантител

Применение в фармакологии

Наноантитела обладают увеличенной степенью проникновения в ткани по сравнению с классическими антителами.

Наноантитела обладают высокой стабильностью при изменениях температуры и химической среды,
имеют большой потенциал для стабильности в желудочно-кишечном тракте.

Нанотела обладают исключительной гибкостью для последующей инженерии.

Наноантитела имеют низкую стоимость и простоту в промышленном производстве.

Наноантитела нашли широкое применение в персонализированной радионуклидной тераностике
(терапии и диагностике) онкологических заболеваний. Они применяются как радиофармпрепараты
для таргетной доставки терапевтических или диагностических изотопов к ткани опухоли.

В феврале 2019 года FDA одобрило первый препарат Каплацизумаб - бивалентное наноантитело
для лечения приобретённой тромботической тромбоцитопенической пурпуры.

Применение в разработке ИФА и ИХА наборов реагентов

Использование одноцепочечных антител (single-domain antibodies, sdAb) - это быстрая
и эффективная альтернатива получению гибридом и классических моноклональных антител.

Применение в науке

Быстрое и недорогое производство наноантител и их конъюгатов с флуоресцентными агентами для использования в клеточной биологии.

Стоимость и сроки получения наноантител зависят от конкретного проекта и обсуждаются индивидуально.

Свяжитесь с нами сейчас, чтобы обсудить ваш проект.

Методика получения VHH фрагментов антител верблюдов, лам, альпак

Получение антигена

Иммунизация животного и получение лимфоцитов

Получение библиотеки бактериофагов и биопеннинг

Получение штамма-продуцента и выделение антител

Анализ антител

Разработка лабораторного регламента получения наноантител

Получение антигена

Для получения VHH к конкретной мишени мы проводим иммунизацию верблюда или акулы нужным антигеном. После получения аминокислотной последовательности антигена (с возможной его модификацией для уменьшения токсичности, повышения выхода и облегчения очистки) мы нарабатываем соответствующий антиген в клетках млекопитающих HEK-293 или бактериях E. coli.

Иммунизация животного и получение лимфоцитов

Двугорбого верблюда последовательно иммунизируем рекомбинантными белками, пептидами или клетками, начиная с небольших доз, постепенно увеличивая дозу в два раза при каждой последующей иммунизации. В качестве адъюванта используем специализированный адъювант, способный вызывать высокую иммуногенность антигена (но без избыточной реактогенности). Иммунизацию проводим с интервалом в неделю или две недели, контролируя нарастание титра АТ к целевому АГ тестированием сыворотки крови верблюда методом прямого твердофазного ИФА. После достижения необходимого титра антител, получения гипериммунной сыворотки, забираем кровь у верблюда в количестве 150-200 мл и выделяем лимфоциты из сыворотки.

Получение библиотеки бактериофагов и биопеннинг

На основе РНК, выделенной из лимфоцитов крови иммунизированных верблюдов, получаем кДНК. Далее при помощи вложенной ПЦР амплифицируем разнообразные последовательности VHH фрагментов антител и в следующем этапе клонируем их в фагмидном векторе. Конечные фагмиды нарабатываем в клетках E. сoli, которые позже инфицируем бактериофагом. В результате трансляции полученные VHH фрагменты оказываются слитыми с белком p3 оболочки фага M13 и в дальнейшем экспонируются на поверхности капсида бактериофага. Полученная фаговая библиотека может быть подвергнута нескольким раундам биопеннинга для отбора наиболее аффинных к определенному антигену VHH фрагментов.

Получение штамма-продуцента и выделение антител

После биопеннинга производим секвенирование клонированной последовательности в отобранной фагмиде. Оптимизируем кодоны в полученной нуклеотидной последовательности целевого VHH фрагмента антитела и клонируем в экспрессионный вектор для наработки белка в штаммах E. coli. Трансформируем конечной плазмидой штаммы и осуществляем скрининг для определения подходящего штамма-продуцента каждого конкретного белка. В дальнейшем оптимизируем условия культивирования и индукции бактериальной культуры для получения наибольшего выхода целевого VHH фрагмента антитела в растворимой форме. Затем масштабируем производство и нарабатываем большие объемы штамма-продуцента в ферментере для дальнейшей очистки VHH фрагментов из влажной биомассы клеток. Используя совокупность хроматографических методов, из биомассы клеток штамма-продуцента выделяем высокоочищенный препарат наноантител верблюдовых.

Анализ антител

Анализ (контроль качества) выделенных и очищенных рекомбинантных VHH антител проводим с использованием следующих методов:

диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих редуцирующих и нередуцирующих условиях для определения чистоты VHH антител;
иммуноферментного анализа на содержание остаточных белков штамма-продуцента;
ЛАЛ-теста на содержание эндотоксинов;
масс-спектрометрического пептидного картирования на подлинность рекомбинантных VHH антител;
различных вариантов иммуноферментного анализа на специфичность взаимодействия с антигеном (мишенью);
биослойную интерферометрию для определения константы диссоциации (Kd) полученных антител;
дифференциальную сканирующую флуориметрию для определения температурной устойчивости и стабильности.

Разработка лабораторного регламента получения наноантител

Разработку опытно-промышленного регламента проводим на основе разработанного лабораторного регламента получения наноантител с проведением контроля качества на ключевых этапах производства наноантител.